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MILENA ELOISA RIBEIRO
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Detecção de FLT3-ITD em neoplasias mieloides por análise de fragmentos: uma abordagem diagnóstica acessível
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Orientador : QUIRINO ALVES DE LIMA NETO
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MEMBROS DA BANCA :
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MARCO AURELIO SCHULER DE OLIVEIRA
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MARILIA GONCALVES QUIRINO DE OLIVEIRA
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QUIRINO ALVES DE LIMA NETO
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Data: 24/07/2026
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Mostrar Resumo
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As neoplasias mieloides correspondem um grupo heterogêneo de neoplasias hematológicas caracterizadas pelo acúmulo de alterações genéticas que influenciam o diagnóstico, prognóstico e definição terapêutica. Entre essas alterações, as duplicações internas em tandem no gene FLT3 (FLT3-ITD) possuem grande relevância clínica, especialmente na leucemia mieloide aguda, onde sua detecção é parte essencial na caracterização molecular dessa doença. Entretanto, métodos mais abrangentes, como o sequenciamento de nova geração (NGS), ainda apresentam limitações relacionadas ao custo e à disponibilidade em muitos serviços de diagnóstico, reforçando a necessidade de metodologias acessíveis, sensíveis e reprodutíveis.
O presente estudo teve como objetivo padronizar a metodologia de PCR associada à análise de fragmentos por eletroforese capilar para a detecção de mutações FLT3-ITD e aplicá-la em 96 pacientes com diferentes neoplasias mieloides da região noroeste do Paraná. Inicialmente, dois pares de oligonucleotídeos iniciadores (primers) previamente descritos na literatura foram comparados durante a etapa de padronização, sendo selecionado somente aquele que apresentou melhor desempenho analítico para as análises subsequentes. A metodologia também foi submetida à avaliação de sensibilidade analítica por meio de diluições seriadas do produto de PCR de uma amostra controle positiva para FLT3-ITD.
A análise de fragmentos identificou mutações FLT3-ITD em 7 das 96 amostras avaliadas, correspondendo a uma frequência de 7,3% na população analisada, sendo observados diferentes tamanhos de duplicação e, em alguns casos, múltiplos picos compatíveis com heterogeneidade clonal. O ensaio de diluição seriada demonstrou detecção da mutação em todas as diluições avaliadas, até 1:200, mantendo intensidade de fluorescência acima do limite analítico recomendado, evidenciando adequada sensibilidade da metodologia. Os resultados demonstram que a PCR associada à análise de fragmentos por eletroforese capilar apresenta potencial para ampliar o acesso ao diagnóstico molecular, especialmente em serviços com acesso limitado a técnicas de maior complexidade, como frequentemente observado no Sistema Único de Saúde (SUS).
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Mostrar Abstract
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Myeloid neoplasms comprise a heterogeneous group of hematologic malignancies characterized by the accumulation of genetic alterations that influence diagnosis, prognosis, and therapeutic decision-making. Among these alterations, FLT3 internal tandem duplications (FLT3-ITD) are of major clinical relevance, particularly in acute myeloid leukemia, where their detection is an essential component of the molecular characterization of the disease. However, more comprehensive approaches, such as next-generation sequencing (NGS), remain limited by their cost and availability in many diagnostic laboratories, highlighting the need for accessible, sensitive, and reproducible methodologies.
The present study aimed to standardize a polymerase chain reaction (PCR)-based fragment analysis assay using capillary electrophoresis for the detection of FLT3-ITD mutations and to apply it to 96 patients with different myeloid neoplasms from the northwestern region of Paraná, Brazil. Initially, two primer pairs previously described in the literature were compared during the standardization process, and only the primer pair showing the best analytical performance was selected for subsequent analyses. The analytical sensitivity of the assay was also evaluated using serial dilutions of the PCR product obtained from an FLT3-ITD-positive control sample.
Fragment analysis identified FLT3-ITD mutations in 7 of the 96 samples analyzed, corresponding to a frequency of 7.3% in the study population. Different duplication lengths were detected, and in some cases, multiple peaks consistent with clonal heterogeneity were observed. The serial dilution assay demonstrated persistent detection of the mutant fragment in all evaluated dilutions, up to 1:200, with fluorescence intensity remaining above the recommended analytical threshold, confirming the adequate analytical sensitivity of the method. These findings demonstrate that PCR-based fragment analysis using capillary electrophoresis has the potential to expand access to molecular diagnosis, particularly in healthcare settings with limited access to more complex molecular techniques, as is frequently the case in the Brazilian Unified Health System (SUS).
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